MENDETEKSI ANTIBODI NEWCASTLE DISEASE PADA ITIK BALI MENGGUNAKAN METODE ELISA

PENDAHULUAN


          Mata kuliah diagnosa klinik merupakan salah satu mata kuliah yang sangat penting dan khusus, sebagai calon dokter hewan diperlukan ketrampilan profesional yang baik dalam menangani pasien, penganalisaan suatu penyakit pada diaknosa klinik yang akurat sampai ke uji laboraturium yang tepat. Pada kuliah yang diberikan oleh Dr.drh. Iwan H Utama,MS mahasiswa di ajarkan cara dan ketentuan dalam uji laboratuirum yang tepat dan akurat. Dalam mendiaknosa suatu penyakit pada uji laboraturium diperlukan metode uji serologi yang baik, maka dari itu pada kesempatan ini saya selaku penulis ingin mengangkat topik tentang uji ELISA pada penyakit ND(Newcastle Disease).

Newcastle Disease (ND) merupakan salah satu penyakit unggas yang masuk kedalam daftar A dari OIE /Office International des Epizootica(OIE,2000 ), yaitu penyakit yang menyebar dengan cepat,menembus batas negara, menyebabkan konskuensi sosio-ekonomis dan implikasi perdagangan global.

Penyakit ini merupakan penyakit menular yang bersifat akut dan epidemik (mewabah) yang disebabkan oleh virus. Virus penyebabnya adalah golongan Paramyxovirus dari famili paramyxoviridae. Penyakit ini sangat merugikan bagi usaha pemeliharaan ternak ayam, khususnya pada pemeliharaan ternak yang dilaksanakan dengan sistem ekstensif (tradisional). Kerugian akibat penyakit ini diperkirakan 340 milyar rupiah pertahun (Sudrajat, 1996)
Virus ND sangat patogen dan V protein merupakan salah satu protein yang menentukan virulensi virus (Huang, et al.,2003) sementara itu hemagglutinin-neuraminidase (HN) protein merupakan protein yang memegang peranan penting dalam proses infeksi (Huang, et al.,2004).

Hampir semua spesies unggas peka terhadap infeksi ND, tetapi ayam adalah spesies yang paling peka (Young, et al.,2002). Laporan tentang kasus penyakit ND pada ayam dan penelitian penyakit ini sudah banyak dilakukan. Namun penelitian tentang kasus penyakit ini pada spesies unggas lainnya seperti itik khususnya itik Bali sangat jarang. Dari beberapa buku disebutkan bahwa itik dapat terserang ND namun tingkat keparahannya tidak separah kejadian pada ayam dan bahkan disebutkan bahwa itk bertindak sebagai karier ND.

Mengingat sistem peternakan di pedesaan di Bali kebanyakan merupakan sistem peternakan tradisional dan dalam satu rumah tangga biasanya dipelihara lebih dari satu jenis ternak dalam jumlah yang tidak terlalu banyak (Suardana dan Suarsana,2003 belum dipublikasikan) maka adanya wabah ND pada ayam kemungkinan erat ada hubungannya dengan itik sebagai reservoirnya.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui adakah itik Bali yang terinfeksi ND, dengan cara melacak keberadaan antibodi pada serumnya. Metode yang dipergunakan utnuk melacak antibodi tersebut adalah metode Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA) dan Western Imunoblotting. Sampel darah diambil dari itik yang dipelihara secara tradisional di daerah pedesaan yang tidak pernah memvaksinasi itik maupun ayamnya dengan vaksin ND. Sehingga, adanya antibodi ND pada sampel yang diperiksa menandakan bahwa itik itu pernah terinfeksi virus ND bukan akibat vaksinasi.

MATERI DAN METODE

Pengambilan dan Penyiapan serum

Sampel darah diambil dari itik Bali yang dipelihara secara tradisional didaerah Sangeh dan Carangsari Kab. Badung serta Padangsambian Denpasar . Itik dikelompokan menjadi dua kelompok yakni itik muda dan dewasa . Sampel itik muda yakni yang berumur antara 2-3 bulan , yang dapat dikumpulkan adalah 22 sampel. Sementara itu sampel dari itik dewasa yakni itik yang telah berproduksi sampai yang akan diafkir berjumlah 97 ekor.
Darah diambil dari vena brachialis (vena di bagian sayap),menggunakan dispossible syringe 2,5 CC yang digunakan sekali pakai. Darah ditampung dalam sebuah tabung reaksi, didiamkan semalam pada lemari pendingin, kemudian serum dipisahkan dengan cara di centrifuge. Sesuai dengan permintaan pihak karantina Jepang, sera dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 700C selama 1 menit untuk membebaskan sera tersebut dari kemungkinan adanya virus Avian Influensa (AI). Kemudian disimpan pada suhu -200C, sampai saatnya dibawa ke Jepang.

Prosedur pemeriksaan ELISA

         Plat mikro ELISA 96 sumuran di Coat selama 16 jam pada suhu 4 0 C dengan antigen ND diencerkan dalam larutan penyangga karbonat-bikarbonat ph 9,6. Antigen virus ND yang digunakan adalah vaksin ND yang mengandung virus tipe B1 (produksi Research Institut for Chemical and Lymph Treatment Japan.) dengan perbandingan 2,4 ml vaksin : 9,6 ml buffer. Setelah diinkubasi pada suhu 4 0 C selama 16 jam, plat mikro dicuci 3 kali dengan Elisa washing buffer (0,01 % Triton –X-100 dalam PBS). Semua sumuran dalam plat mikro selanjutnya diblok dengan 200 ml susu skim 3 % dalam PBS. Plat mikro diinkubasikan selama 1 jam pada suhu 37 0 C dan dicuci sebanyak tiga kali seperti diatas. Ke dalam setiap sumuran kemudian ditambahkan serum itik yang diuji dengan pengenceran 1:200 (1 serum : 200 PBS).

        Sebagai kontrol positif dipakai serum itik sampel yang positif dengan uji western imunoblotting. Sebagai kontrol negatif dipakai 2 sumuran yang diisi FCS (fetal calf serum ), 2 sumuran yang tidak diisi antibodi I dan 1 sumuran yang tidak diisi antibodi I dan II .
Setelah inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 0 C dan pencucian sebanyak 3 kali ke dalam sumuran plat mikro ditambahkan antiduck Ig G (KPL ) yang dilabel dengan horse radish peroxidase (HRP).

        Selanjutnya plat mikro diinkubasi kembali selama 1 jam pada suhu37 0 C, kemudian dicuci sebanyak tiga kali seperti diatas. Sesudah itu kedalam masing-masing sumuran ditambahkan 100 ml substrate solution (0,04% OPD dan 0,003 % H202 dalam Phospate Citrate buffer) dan diinkubasikan pada suhu kamar di tempat yang gelap tanpa dibungkus. Akhirnya ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 50 ml stop solution (H2SO4 6 N ).Perubahan warna menjadi coklat menandakan sampel tersebut positif.
Hasil dibaca secepatnya pada Elisa plate reader dengan panjang gelombang 490 nm. Nilai optical density ( OD ) yang didapat kemudian ditabulasi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

       Hasil pemeriksaan antibodi ND dalam serum itik Bali dengan uji ELISA menunjukkan bahwa hasil positif ditemukan pada sebagian besar sample yang diperiksa (91.6%). Hasil positipditandai dengan perubahan substrat OPD dari bening sedikit kekuningan menjadi coklat kekuningan. Perubahan warna substrat ditemukan juga pada serum kontrol positip tetapi tidak pada kontrol negatip (Gambar 1)
Perubahan warna muncul karena pada mikroplat yang berisi serum yang mengandung antibodi ND terjadi ikatan antigen-antibodi. Ikatan ini kemudian terlacak dengan antiduck-IgG yang dilabel dengan enzim horse radish peroksidase.

        Enzim inilah yang mengubah OPD dari bening kekuningan menjadi coklat kekuningan. Tingkat kepekatan warna coklat dibaca dengan multiscan spectrophotometer dan dinyatakan dalam kerapatan optis (Optical Density/OD). Makin pekat intensitas warna coklat makin tinggi nilai OD-nya dan makin tinggi pula titer antibodi ND dalam serum yang diperiksa.

        Dalam penelitian ini serum dinyatakan positif mengandung antibodi ND bila OD-nya sekurang-kurangnya 3 kali nilai OD rata-rata kontrol negatif. Kriteria ini dipakai karena pada uji western immunoblotting, hasil positip bila nilai OD pada uji ELISA sekurang-kurangnya 3 X nilai OD kontol negatif.

        Berdasarkan kriteria itu sebanyak sebanyak 109 (91,6%) dari 119 sampel serum itik Bali dinyatakan positip mengadung antibodi ND (Tabel 1). Berdasarkan kelompok umur, diperoleh hasil bahwa hasil positip ELISA itik Bali muda (umur 2-3 bulan) adalah sebesar 86,4% dan pada itik dewasa (umur 6 bulan atau lebih )sebesar92,8%.
Ada kecenderungan bahwa antibody ND lebih banyak ditemukan pada itik dewasa jila dibandingkan itik muda. Namun analisis statistik dengan uji X2 dipreoleh hasil yang tidak berebeda nyata (p>0,01).

        Keberadaan antibodi ND dalam serum itik Bali ini menunjukkan bahwa itik pernah terinfeksi virus ND. Infeksi ND pada itik yang dipakai dalam penelitian ini sangat mungkin terjadi secara alami mengingat sampai saat ini belum pernah dilakukan vaksinasi ND pada itik Bali.

        Penularan virus ND pada itik sangat mungkin terjadi melalui kontak langsung antara itik dan ayam yang dipelihara secara bersama-sama. Penularan ini dimungkinkan karena ND di Indonesia bersifat endemic dan secara klinis umumnya ditemukan pada ayam yang tidak kebal terhadap ND (Sudardjat, 1990) Sementara itu, infeksi virus ND pada unggas air dari familia Anahdae termasuk itik juga pernah dilaporkan (Lancaster dan Alexander,1972). Meskipun belum ada laporan yang menyatakan adanya kesamaan virus penyebab ND pada ayam dan itik (secara molekuler dan taksonomik), hal ini perlu dicermati mengingat sulitnya pembrantasan kasus ND pada ayam di Bali.